中日友好医院 口腔医学中心 100029

摘要：目的：分析健康口腔分离细菌对牙膏中常用抗菌防腐剂的敏感性，评估现行防腐剂最大允许剂量对口腔菌群的潜在影响。方法于2024年1月至2025年3月，采集20例健康成人口腔样本，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）和16SrRNA测序对分离的20株口腔菌进行种属鉴定，并采用微量肉汤稀释法测定其对6种牙膏防腐剂（苯甲酸钠、苯扎氯铵、三氯生、氯己定、山梨酸钾及对羟基苯甲酸甲酯）的最低抑菌浓度（MIC）。结果种属鉴定显示，20株口腔菌中链球菌属占55%（11/20）、奈瑟氏菌属占30%（6/20）、葡萄球菌属占15%（3/20）。MIC测定表明，6种防腐剂对口腔菌的抑制浓度显著低于GB22115-2008规定的最大允许剂量，其中苯甲酸钠的允许浓度高于其MIC约4~32倍，三氯生允许浓度超过MIC达16~128倍。结论牙膏中部分防腐剂在现行标准下的使用剂量可能对口腔共生菌群产生抑制或杀灭作用。建议在制定防腐剂安全限值时，除毒理学数据外，需结合口腔微生物的抗菌敏感性，以维护口腔微生态平衡。

关键词：健康口腔；分离细菌；牙膏；抗菌防腐剂

引言

口腔菌群是维持口腔健康的重要生态屏障，其组成失衡与龋病、牙周炎等疾病密切相关。牙膏中广泛添加的抗菌防腐剂虽可抑制致病菌，但可能因浓度不当干扰共生菌群稳态。现行GB22115-2008标准主要依据毒理学数据设定防腐剂限值，缺乏对口腔微生物敏感性的系统评估。本研究通过分析健康口腔分离菌对6种常用防腐剂的最低抑菌浓度（MIC），揭示其敏感性差异，旨在为平衡口腔护理产品的抗菌效能与微生态安全性提供科学依据。

1资料与方法

1.1一般资料

本研究于2024年1月至2025年3月开展，纳入20例健康成年志愿者（年龄22~45岁，男女各10例），均无口腔疾病史、未使用抗生素或含抗菌成分的漱口水≥1个月。口腔样本通过无菌拭子采集颊黏膜、舌背及龈沟菌斑，接种于哥伦比亚血琼脂平板（含5%脱纤维羊血），于37℃、5%CO₂条件下培养48小时，分离纯化后获得20株口腔共生菌。所有菌株经革兰染色初步鉴定为革兰阳性球菌或革兰阴性双球菌，后续通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOFMS）和16SrRNA测序进一步鉴定至种属水平。

1.2方法

菌株鉴定：采用MALDI-TOFMS（布鲁克MicroflexLT系统）对分离菌株进行蛋白质谱分析，匹配分值≥1.90判定为可信种属；同时提取细菌基因组DNA，通过16SrRNA基因通用引物27F/1492R进行PCR扩增，产物纯化后送生工生物测序，序列经BLAST比对NCBI数据库，相似度≥99%且覆盖度≥97%确认为目标菌种。

最低抑菌浓度（MIC）测定：参照CLSIM07-A11标准，采用微量肉汤稀释法检测6种牙膏防腐剂（苯甲酸钠、苯扎氯铵、三氯生、氯己定、山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯）对20株口腔菌的抗菌活性。将防腐剂母液用MH肉汤倍比稀释为0.0005%~1.0%（质量分数）共12个浓度梯度，接种菌悬液（1×10⁶CFU/mL），37℃培养24小时后读取MIC值（肉眼观察无细菌生长最低浓度）。实验设空白对照（未接种菌液）及质控菌（金黄色葡萄球菌ATCC25923），每组重复3次。

1.3观察指标

（1）口腔分离菌株的种属分布（链球菌属、奈瑟氏菌属、葡萄球菌属占比）；（2）6种牙膏防腐剂（苯甲酸钠、苯扎氯铵等）对菌株的最低抑菌浓度（MIC）；（3）MIC值与GB22115-2008标准允许浓度的比值；（4）不同菌属对防腐剂的敏感性差异（以MIC倍数变化及统计学P值评估）。实验通过MALDI-TOFMS鉴定分值（≥1.90）及16SrRNA序列相似度（≥99%）确保菌株鉴定准确性，并以质控菌株（金黄色葡萄球菌ATCC25923）验证MIC测定可靠性。

1.4统计学方法

SPSS19.0用于分析和处理特定测量数据（x±s）的数据。以%为单位计算数据，并用χ2检查数据；P>0.05无统计学意义。

2结果

2.1口腔分离细菌的鉴定分析

从20例健康成人口腔样本中共分离得到20株口腔菌，种属鉴定结果见表1。MALDI-TOFMS和16SrRNA测序结果显示，分离菌株主要为链球菌属（55%，11/20），包括副血链球菌（n=3）、唾液链球菌（n=3）、口腔链球菌（n=2）、缓症链球菌（n=1）、嵴链球菌（n=1）和肺炎链球菌（n=1）；其次为奈瑟氏菌属（30%，6/20），包括微黄奈瑟氏菌（n=2）、粘液奈瑟氏菌（n=2）和浅黄奈瑟氏菌（n=2）；另有少量葡萄球菌属（15%，3/20），包括人葡萄球菌（n=2）和溶血葡萄球菌（n=1）。所有菌株经MALDI-TOFMS鉴定分值≥1.90，16SrRNA序列相似度>99.30%，覆盖度>97%。

表1健康人群口腔分离菌株的种属鉴定结果

2.2牙膏防腐剂的最低抑菌浓度（MIC）

6种防腐剂对口腔菌的MIC测定结果见表2。结果显示：奈瑟氏菌属（n=6）对苯甲酸钠、三氯生和氯己定高度敏感，MIC值仅为GB22115-2008最大允许浓度的1/8~1/32。其中，2株浅黄奈瑟氏菌对三氯生的MIC低至0.004%（质量分数），为GB标准的1/128。链球菌属（n=11）对山梨酸钾和苯甲酸钠的耐受性较强，MIC值为GB标准的2~8倍；但对氯己定敏感，MIC范围为0.008%~0.016%（质量分数），为GB标准的1/16~1/8。葡萄球菌属（n=3）对苯扎氯铵的MIC值高达0.5%（质量分数），为GB标准的4倍；而对羟基苯甲酸甲酯的MIC值（0.025%~0.05%）与GB标准（0.4%）相比低8~16倍。

表2牙膏防腐剂对口腔菌的MIC值及与GB标准的比较

3讨论

健康成人口腔分离细菌对牙膏中常用抗菌防腐剂的敏感性，揭示了现行防腐剂使用标准对口腔菌群的潜在影响，研究结果表明，不同口腔菌属对防腐剂的敏感性存在显著差异，且部分防腐剂的最高允许浓度（GB22115-2008）远高于其实际抑菌浓度，可能对口腔微生态平衡造成干扰。

本研究发现，奈瑟氏菌属对苯甲酸钠、三氯生等防腐剂的敏感性最高，其MIC值仅为GB标准的1/8~1/128。奈瑟氏菌属作为口腔共生菌的重要组成部分，参与维持口腔pH稳定及抑制致病菌定植。若牙膏中防腐剂浓度长期高于其MIC，可能导致奈瑟氏菌属丰度下降，破坏其与宿主及其他菌群的互作平衡，进而增加机会性致病菌（如变形链球菌）的增殖风险。值得注意的是，1株浅黄奈瑟氏菌对山梨酸钾的MIC值超过GB标准2倍，提示菌株间可能存在耐药性分化，需进一步探究其基因突变或代谢适应性机制。相比之下，链球菌属对苯甲酸钠和山梨酸钾表现出较强耐受性（MIC为GB标准的2~8倍）。链球菌属在口腔中占据主导地位，其代谢产物（如乳酸）可抑制病原菌生长并促进牙釉质再矿化[2]。高耐受性可能与其细胞壁结构（如厚肽聚糖层）或主动外排泵系统有关[3]，但长期暴露于高浓度防腐剂仍可能筛选出耐药菌株，甚至通过基因水平转移加剧耐药性扩散。此外，部分链球菌（如口腔链球菌）对氯己定的高度敏感（MIC为GB标准的1/16~1/8）提示，单一防腐剂的广泛使用可能导致菌群内部“此消彼长”，加剧微生态紊乱。葡萄球菌属对苯扎氯铵的MIC值高达GB标准的4倍，但对羟基苯甲酸甲酯的敏感性较强（MIC为标准的1/16~1/8）。葡萄球菌属在健康口腔中占比虽低，但其耐药性可能与其生物膜形成能力相关[4]。若防腐剂长期抑制敏感菌而耐药菌持续存活，可能引发局部菌群失调，甚至促进条件致病菌（如金黄色葡萄球菌）的定植。

本研究涉及的6种防腐剂通过不同机制发挥抗菌作用，苯甲酸钠干扰细胞膜通透性，三氯生抑制脂肪酸合成酶（FabI），氯己定破坏细胞膜完整性。奈瑟氏菌属作为革兰阴性菌，其外膜脂多糖可能增强三氯生的渗透效率，而链球菌属的厚细胞壁或限制苯甲酸钠的膜损伤作用。此外，防腐剂浓度与作用时间的差异可能导致“亚抑菌浓度效应”，即低浓度防腐剂虽不直接杀菌，但可能诱导菌群代谢途径改变或毒力因子表达[6]。例如，苯扎氯铵在亚抑菌浓度下可增强细菌生物膜形成能力，反而不利于口腔清洁。

GB22115-2008标准主要基于防腐剂的急性毒性和皮肤刺激性数据制定，缺乏对口腔菌群敏感性的系统评估。本研究表明，三氯生和氯己定的允许浓度（0.3%和0.2%）远超其MIC值（0.004%~0.016%），可能导致过度抑制共生菌。因此，建议将口腔微生物敏感性纳入防腐剂安全评估体系，并针对不同菌属设定差异化浓度阈值。例如，对奈瑟氏菌属敏感的防腐剂（如三氯生）可降低使用上限，而对链球菌属耐受的防腐剂（如苯甲酸钠）需警惕耐药性演化风险。

结束语

综上所述，牙膏中部分防腐剂（如三氯生）的允许浓度显著高于口腔共生菌的MIC值，可能引发菌群抑制甚至失衡。建议在标准修订中整合微生物敏感性数据，建立差异化阈值以兼顾抗菌效果与生态保护。未来需扩大菌株多样性、模拟口腔动态环境，并探索防腐剂联用的长期影响，为“精准防腐”策略和口腔微生态导向的日化产品开发奠定理论基础。

参考文献

[1]屈腾飞.黄芩苷的蜡质热熔薄膜包衣微囊化及抑菌抗溃疡牙膏的开发[D].华南理工大学,2023.

[2]张冰洁.基于益生菌和酶的抑制牙菌斑牙膏的应用研究[D].天津科技大学,2023.

[3]常慧敏.益生菌牙膏和SLS对大鼠口腔疾病及口腔微生态的影响[D].天津科技大学,2023.

[4]吴颖嫦.海藻酸钠-多巴胺/亚铁离子涂层的抑菌性能研究及其口腔护理应用[D].江南大学,2022.

[5]史婷婷.牙膏及牙膏中的表面活性剂对口腔微生态影响的研究[D].天津科技大学,2022.

[6]孔俊豪.茶黄素的酶促制备及其促进口腔微生态活性的评价[D].浙江工商大学,2022.